유전공학점검) RNA isolation from animal cells 이야~~

검토 목적 Animal cell중에서 우리가 원하는 gene이 발현되는지를 RNA수준에서 조사하고자 할 때, cell에서 RNA를 순수 분리하는 과정에 필요하다.검토기구 및 재료

→ 잘 녹지 않아 65℃ dry oven에서 1가끔 정도 둔다. → 0.45㎛ filter에서 filtering→ add 1.3ml of 2-mercaptoethanol(final 0.1M)​·Acidic phenol(pH4.0)phenol:chloroform:isoamylalcohol, 100%EtOH, 70%EtOH, DEPC-dH2O, 2M sodium acetate(pH4.0), isopropanol​ ​ ​ 실험 방법 → Quick phenol method(for RNA prep)(35mm dish기준)① completely grown cells② remove medium and wash twice③ add 1ml of solution D and incubate at RT for 5-10min④ dividing a respective samples into 1.5ml tube⑤ add 50㎕ of 2M sodium acetate(pH 4.0)and inverting⑥ add 500㎕ of phenol:chloroform:isoamylalcohol(P-1944 sigma), vortex and place on ice for 5min⑦ centrifuge(10,000g, 4℃, 20min)⑧ transfer a sup into새 tube⑨ add equal volume of isopropanol, vortex and place-20℃ for 1hr⑩ centrifuge(10,000g, 4℃, 20min)⑪ collect the pellet(RNA)⑫ 70%EtOHwashing× 2⑬ air dry for 1min and resuspend 100㎕ of TE or DEPC-dH2O RNA정량(UV spect)⑭ add 10㎕ of 5M NaCl and 200㎕ of 100%EtOH⑮ place on-70℃ ⑯ centrifuge(10,000g, 4℃, 30min)(as much as is necessary)⑰ add 400㎕ of 70%EtOH⑱ centrifuge(10,000g, 4℃, 10min)⑲ resuspend of DEPC-dH2O​ ​ ​ 실험의 원리 1.RNA(1)정의:RNA(Ribonucleic Acid)오탄당의 1종의 ribose를 바탕소반에 nucleotide를 이루는 핵산의 한 종류(2)구조:오탄당잉 ribose를 기반으로 사슬 구조를 이루는 것

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(3)특징 하나)단백질을 합성하는 과정에 작용 2)헥욤키에 DNA와 달리 T(Thymine)대신 U(Uracil)을 가토 썰매 3)바이러스와 같은 하나부 미생물에서 유전자로서 기능 대부분의 진핵 생물과 다세포 생물로 단백질의 형성 과정을 맛소리 ​ 2.RNA isolation(하나)column을 이용한 kit:세포 파괴 → RNA 흐르고 나쁘지 않아서 온 것 → column에 결합 → column을 여러 차례 washing하고 protein, DNA등 불순물 제거 → RNA분리(2)Tri-reagent(Trizol)하나)Trizol:acid phenol과 같은 기능 → 단백질 변성, 지질 녹여서 세포막 파괴&DNA변성시키는 것.알칼리:DNA안정, RNA분해 하나오남/산성:DNA depurination, RNA안정 ∴ Trizol처리:RNA추출, DNA 2)Trizol속의 guandine isothiocyonate, phenol:RNase억제 3)DEPC:오염 방지(RNase inhibitor)4)phenol/chloroform:단백질 제거 5)isoprophanol:RNA침전 6)EtOH:RNA pellet을 washing​ 3.Total RNA① rRNA(ribosomal RNA):ribosome을 구성하는 RNA② tRNA(transfer RNA):단백질을 만들어 아미노산을 가진 ribosome에 옮기고 줌 ③ mRNA(messenger RNA):타가은팍질을 만들기 위해서 거푸집에서 이용 ​ ​ ​ 예상 결과 RNA을 분리하여 전기 영동을 걸면 3개 band가 기르다 가였다 Total RNA가 총 3개를 갖고 있기 때문에 크기 순으로 28S(rRNA)하나 8S(tRNA)5S(mRNA)이 기르다 가였다 이때 mRNA는 total RNA의 0.3퍼.센트 미만에서는 잘 보이지 않을 수 있다.참고 https://ko.wikipedia.org/wiki/RNAhttps://sites.google.com/site/inumobilab/lecture/gang-ui/mauibunlihttp://cms.dankook.ac.kr/web/biophysi/gene-cloning?p_p_id=Bbs_WAR_bbsportlet&p_p_lifecycle=0&p_p_state=normal&p_p_mode=view&p_p_col_id=column-2&p_p_col_count=하나&_Bbs_WAR_bbsportlet_curPage=하나&_Bbs_WAR_bbsportlet_action=view_message&_Bbs_WAR_bbsportlet_messageId=36565https://www.scienceall.com/단국 대학교 분자 생물학과의 조사서 ​ ​

결과

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RNA농도:356.5ng/㎕ ​ ​ ​ 고찰 A549(lung cancer cell)에서 분리된 RNA의 농도는 356.5ng/㎕로 그대로가 나왔다. A260/A280은 1.90으로 정상적인 비율인 2.0이상이 나오지 않고 purity이 떨어진다는 것을 알 수 있다. protein이나 phenol도 다른 오염물질이 포함되어 있기 때문인 것 같다. 280nm에서 흡수되는 오염 물질이 포함된 것이었다 ​ ​ ​ 추가 정보 ​ 1.A260/A280 VS A260/A230

​ 2.RNA가 DNA보다 높은 흡수도가 내게 올 이유

참고:https://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/nanodrop.pdf